image: 报告RNA富集的双sgRNA核蛋白（reporter RNA enriched dual-sgRNA/CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins, RE-DSRNP）高效编辑技术体系由双sgRNA编辑系统和报告RNA富集的核糖核蛋白（CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins, RNP）编辑系统相结合。双sgRNA系统具有精确和高效编辑的特性，报告RNA富集的RNP系统具有transgene-free、编辑效率高、细胞毒性低、脱靶效应低的特性。因此，利用RE-DSRNP制备基因编辑核移植供体细胞无需单克隆筛选过程，将供体细胞的制备时间从原来的3-4周减少到1周。利用RE-DSRNP技术高效制备WIP1基因编辑雄性繁殖模型猪的应用：32头断奶克隆猪中，31头(97%)为WIP1基因编辑型，15头(47%)为预期的38bp DNA片段缺失纯合子类型；所有的克隆猪中均未检测到脱靶。WIP1基因编辑梅山猪表现出明显的雄性繁殖障碍表型。 view more
Credit: ©《中国科学》杂志社
基因编辑猪在农业和医学等领域具有重要的应用价值。然而，在制备基因编辑猪的过程中还存在需要改进的方面，例如：（1）难以快速获得大量基因型一致的个体；（2）质粒DNA可能随机整合到细胞的基因组；（3）单克隆细胞筛选过程可能降低供体细胞的质量。
近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物基因工程与种质创新团队联合深圳农业基因组所动物基因组中心在Science China Life Sciences上在线发表了题为A transgene-free method for rapid and efficient generation of precisely edited pigs without monoclonal selection的研究论文。该研究开发了一种名为报告RNA富集的双引导RNA核蛋白（reporter RNA enriched dual-sgRNA/CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins，RE-DSRNP）高效编辑技术体系，可用于快速制备无外源DNA（Transgene-free）基因编辑克隆猪；并利用该体系成功获得了WIP1基因编辑的雄性繁殖障碍模型猪。
文章中，研究人员使用双引导RNA，提高了编辑精度和效率；使用核糖核蛋白（CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins，RNP）编辑系统，成功避免质粒DNA整合到基因组的风险，实现低脱靶、低毒、Transgene-free编辑；并将报告RNA富集系统与DSRNP有机结合，在进一步提高基因编辑效率的基础上，无需单克隆细胞筛选过程，不仅使核移植供体细胞的培养时间由3-4周缩短为1周，而且显著降低了发生凋亡和染色体异常的供体细胞比例。
为了验证RE-DSRNP在创制基因编辑克隆猪上的应用效果，研究人员以高繁殖力著称的我国地方猪种--梅山猪为材料，利用RE-DSRNP体系靶向编辑WIP1基因，结果表明：获得的32头断奶克隆猪中，31头(97%)为WIP1基因编辑型，15头(47%)为预期的38 bp DNA片段缺失纯合子类型；所有的克隆猪均未检测到脱靶。同时，WIP1基因编辑猪表现出明显的雄性繁殖障碍表型。种公猪在育种体系和商品生产中举足轻重，对母猪繁殖力具有决定性作用，该文首次构建了WIP1基因编辑猪模型，对于深入研究雄性繁殖机制具有重要意义。
体细胞克隆基因编辑技术是目前动物生物育种和医学模型研发的主流技术。该文研发的RE-DSRNP体系，将显著降低脱靶和非预期效应，大大提高效率，缩短制备时间，预计将推动猪和其他大动物的生物育种和医学模型研发进程，具有广阔的应用前景。
Journal
Science China Life Sciences