image: (A) 丝状真菌启动子文库的建立; (B) 构巢曲霉高通量原生质体制备方法; (C)利用流式细胞仪单细胞荧光检测手段在单细胞水平表征的真菌启动子高通量筛选方法; (D) 利用启动子元件激活沉默基因簇，发现新型活性分子; (E) 与PgpdA相比，强度水平高于1.5倍以上的丝状真菌启动子文库。 view more
Credit: ©《中国科学》杂志社
真菌来源的天然产物结构复杂多样，具有抗感染、抗肿瘤和免疫抑制等多种活性，是药物和药物前体的重要来源。近年来随着基因组测序技术的迅速发展，发现真菌大多数生物合成基因簇是“沉默”的，如何开发有效的激活策略已成为挖掘真菌天然活性产物的亟待解决的关键问题。启动子工程改造是激活基因簇的有力手段，但是在丝状真菌中，数量过少的启动子和繁琐耗时的鉴定方法制约了该方法的应用，因此，如何高效快速的鉴定并评估启动子强度一直是研究的热点。
该研究首先建立了构巢曲霉高通量原生质体制备方法，并结合流式细胞仪单细胞荧光检测手段，创建了基于单细胞水平表征的真菌启动子高通量筛选方法，能够更高效、快速、精确地定量表征启动子表达强度。系统分析了来源于Aspergillus Genome Database (AspGD)数据库构巢曲霉的454个转录因子，从中筛选出93个与次级代谢相关的转录因子启动子作为研究对象，并借助高通量筛选方法，对其表达强度进行了精确评估，获得了相对表达强度高达37倍的天然启动子文库。其中，有两个启动子PzipA和PsltA的表达强度是组成型启动子PgpdA的2.9和1.5倍。
为评估新高通量筛选方法的精确性，该研究随机选择不同强度水平的启动子，利用qRT-PCR对其负责的SfGFP基因表达量进行测定；通过共聚焦显微镜观察荧光强度；用于激活沉默的免疫抑制剂neosartoricin生物合成基因簇，并计算neosartoricin产量，以反映启动子表达水平。结果表明，利用以上三种手段表征的启动子强度水平均与启动子文库一致，证明最新建立的基于单细胞水平表征的真菌启动子高通量筛选方法能够可靠、准确地表征启动子强度。
此外，该研究还利用筛选出的两个强启动子PzipA和PsltA，替换烟曲霉非核糖体多肽合成酶基因Afpes1的原始启动子，成功激活该沉默基因，并通过天然产物分离鉴定两个新型环四肽化合物，命名为fumiganins A和B。鉴于前人对Afpes1基因的研究，该研究推测其产物fumiganins可能与烟曲霉氧化胁迫响应机制及毒力作用相关。
综上所述，该研究开发了一种基于流式细胞的单细胞定量方法来精确评估基因启动子，并以丝状真菌构巢曲霉为模型，表征并构建了包含93个本地启动子的调控元件文库，为丝状真菌启动子的定量表征提供了一种高效的筛选策略；同时也为微生物调控元件的开发提供了新的途径，将促进真菌新型天然产物发现和合成生物学创制。
研究详情请见原文：
Quantitative characterization of filamentous fungal promoters on a single-cell resolution to discover cryptic natural products
https://doi.org/10.1007/s11427-022-2175-0
Journal
Science China Life Sciences