image: (a) 显示用DAPI染色的FGO中染色质的荧光图像。比例尺为20 μm。黄色三角形指示DAPI密集的异染色质焦点，红色三角形指示核仁或NLBs。(b) 免疫荧光图像展示了WT和CKO FGO染色质上的HP1α信号。黄色三角形指示DAPI密集的异染色质焦点。比例尺为20 μm。（c） 热图展示了通过ATAC-seq检测到的WT和CKO FGO中染色质可及性的峰值增益和损失。 (d) WT和CKO GO/FGO中从转录起始位点（TSS）到转录终止位点（TES）的总体染色质可及性。(e) WT和CKO GO/FGO中rDNA的染色质可及性。(f) 在WT和CKO GO/FGO中富集的独特基序。 view more
Credit: ©《中国科学》杂志社
G-四链体（G-quadruplex, G4）是由富含鸟嘌呤的DNA或RNA序列通过四个鸟嘌呤之间的Hoogsteen氢键配对形成的特殊核酸二级结构。DHX36 (又名RHAU）被报道为一种从人类细胞裂解液中捕获和纯化的G4解旋酶。已有研究表明，DHX36通过解开G4结构，参与细胞内转录及转录后过程，在精子发生和心脏发育等生理过程中发挥重要作用。然而，DHX36在哺乳动物卵子和早期胚胎发育中的功能尚不明确。
研究发现DHX36在小鼠卵巢组织中高表达，且主要定位于细胞核。随着卵母细胞的生长发育，核仁构象转变，DHX36逐渐从核质转移至核仁。为探究DHX36在卵母细胞发育中的功能，研究团队利用Cre-LoxP系统构建了卵母细胞条件性敲除(CKO)小鼠模型，发现DHX36-CKO小鼠完全不育，并伴随着严重的激素响应及排卵障碍。
进一步研究显示，DHX36-CKO卵母细胞的减数分裂成熟和受精后胚胎发育受阻，表现为：（1）大多数卵母细胞减数分裂受阻，无法发生核膜破裂（GVBD）并排出第一极体；（2）排出第一极体的卵母细胞染色体排列和纺锤体组装紊乱，部分卵母细胞染色体无法维持正常倍性；（3）小鼠卵子在自然交配后大多无法正常受精形成原核；（4）受精卵在后续发育过程中多数停滞于受精卵阶段，少部分发育至2细胞后阻滞。
为了进一步了解DHX36在卵子功能中的机制，研究人员对染色质构象和开放性进行了分析，发现DHX36-CKO小鼠卵母细胞中的核仁类似体（Nucleolus-like Body, NLB）体积增大，异染色质凝集斑块减小，组蛋白修饰（H3K4me3, H3K9me3和H3K27me3）显著降低，异染色质标记蛋白HP1α分布更为弥散。ATAC-Seq分析显示，DHX36缺失导致染色质开放性降低，特别是在转录起始位点和rDNA开放区域，并且那些染色质开放的区域富含G4序列。
接下来，研究团队利用Smart-seq2技术对各阶段卵母细胞及受精卵进行了RNA测序（RNA-seq），发现母源转录本转录不足与清除障碍。基因本体功能分析揭示，差异表达基因主要富集于DNA转录因子活力、核糖核蛋白发生和rRNA加工等通路。进一步检测发现pre-rRNA在DHX36-CKO卵母细胞中表达紊乱，在生长时期的卵母细胞（Growing Oocytes, GO）中的水平不足，在完全生长的卵母细胞（Fully-grown Oocytes, FGO）中异常累积，且翻译活性显著下降。
使用小分子G4荧光探针（CYTO）和G4抗体BG4，研究发现DHX36-CKO卵母细胞核仁及核质中G4显著累积。rDNA开放区域（与pre-rRNA序列相同）富含多个G4序列，且这些序列能够在体外形成G4结构，并与DHX36蛋白结合。研究推测，DHX36缺失导致rDNA上的G4结构积累，抑制pre-rRNA转录。
为什么pre-rRNA在DHX36-CKO FGO中会积累？体外实验显示，使用G4稳定剂PDS处理细胞会导致pre-rRNA不易被RNase消化。DHX36与pre-rRNA及G4在早期胚胎中的分布具有高度一致性，RIP-qPCR分析显示DHX36通过其特异性结构域（RSM）直接结合pre-rRNA。回补DHX36后，CKO卵母细胞中pre-rRNA的积累程度有所减轻。研究认为，DHX36在卵母细胞从GO到FGO发育过程中，通过解开G4结构确保pre-RNA的正常剪切，而在DHX36-CKO卵母细胞中，G4结构积累阻碍pre-rRNA剪切，最终导致核糖体组装和翻译受阻。