image: On the left, modified luciferase applied to mammalian cells generates an acidity traffic light: pH 6 (red), 7 (yellow) and 8 (green); on the right, firefly discovered at UFSCar in 2006
Credit: Gabriel Pelentir and Vadim Viviani
El gen que codifica una enzima de una luciérnaga descubierta en el campus de Sorocaba de la Universidad Federal de São Carlos (UFSCar), en Brasil, dio origen a un biosensor capaz de indicar cambios de pH en células de mamíferos —algo que puede ser útil en el estudio de enfermedades o en la evaluación de la toxicidad de posibles fármacos, por ejemplo.
La luciferasa de la especie Amydetes vivianii cambia de color, pasando de verde-azulado a amarillo y rojo, a medida que disminuye la acidez en fibroblastos, el tipo celular más común del tejido conectivo. Todo esto con gran intensidad y estabilidad, algo que no se había logrado con otras luciferasas probadas por el grupo de investigadores.
El trabajo, apoyado por la FAPESP, fue publicado en la revista Biosensors.
Las luciferasas son enzimas presentes en seres vivos bioluminiscentes que producen luz al oxidar la luciferina, un compuesto que también debe estar presente en el proceso. La luciferasa estudiada en esta investigación proviene de una especie descubierta en 2006 por uno de los coordinadores del estudio, Vadim Viviani, coordinador del Laboratorio de Bioquímica y Tecnologías Bioluminiscentes de la UFSCar. La enzima fue clonada por su grupo de investigación en 2011.
“Dentro de la célula, los cambios de pH pueden ser indicadores de procesos como la homeostasis, la proliferación y la muerte celular, entre otros. Nuestra técnica tiene potencial para estudiar enfermedades o la toxicidad de medicamentos, por ejemplo”, señala Vanessa Bevilaqua primera autora del artículo y becaria de posdoctorado en la Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud de la Pontificia Universidad Católica de São Paulo (PUC-SP), campus Sorocaba.
El trabajo fue realizado en los laboratorios coordinados por Viviani, en la UFSCar, y por Eliana Duek, en la PUC-SP. Duek también cuenta con apoyo de la FAPESP.
Otras luciferasas probadas por el grupo producían una luz rojiza y cambiaban menos de color a una temperatura de 36 °C, que es la temperatura de funcionamiento de las células de mamíferos.
“La nueva luciferasa fue modificada para expresarse mejor en células de mamíferos. Además de presentar una mayor amplitud en el cambio de color de la luz, tiene una estabilidad superior y proporciona un brillo [intensidad] más fuerte. La técnica no es tóxica y no depende de una fuente externa de luz, como sucede en el caso de la fluorescencia, otra forma de usar luz para estudiar células”, explica Viviani.
En los ensayos realizados por el grupo, además de capturar imágenes de la bioluminiscencia con cámaras de fotodetección, fue posible fotografiar la luz emitida por las luciferasas en las células de mamíferos incluso con la cámara de un teléfono celular.
El brillo fue intenso durante los primeros 30 minutos, momento en que comenzó a disminuir. Aunque más débil, se mantuvo durante al menos 12 horas, aunque solo pudo ser detectado con un equipo avanzado de fotodetección.
“Con esto, es posible utilizar el color de la luz para indicar el pH dentro de las células, incluidas las humanas, e inferir si existe estrés celular u otro efecto relacionado con la acidez. Es algo inédito y que desarrollamos completamente en Brasil”, añade Viviani.
El trabajo forma parte del proyecto “Desarrollo de insumos bioluminiscentes para inmunoensayos, análisis ambientales y bioimagen”, apoyado por la FAPESP y coordinado por Viviani.
Otros coautores son Gabriel Pelentir, becario de doctorado en la UFSCar, y Moema Hausen, profesora en la PUC-SP.
Antecedentes
En estudios anteriores, los investigadores ya habían desarrollado la aplicación de la luciferasa de otra luciérnaga, del género Macrolampis, para indicar el pH en células bacterianas (lea más en: agencia.fapesp.br/20620).
Sin embargo, cuando se probó en células de mamíferos, la bioluminiscencia emitida por la luciferasa de Macrolampis era muy rojiza y variaba poco con los cambios de pH, además de no presentar estabilidad por encima de los 36 °C, lo que disminuía la efectividad necesaria para este tipo de células.
El grupo de Viviani también desarrolló durante la pandemia un inmunoensayo que puede ser usado para detectar COVID-19, basado en la luciferasa de Amydetes vivianii, que brilla al entrar en contacto con anticuerpos contra el SARS-CoV-2 (más información en: agencia.fapesp.br/36449).
Con el trabajo ahora finalizado, el laboratorio liderado por el profesor de la UFSCar, que ya contaba con una infraestructura única para estudios y aplicaciones de la bioluminiscencia, también adquiere capacidad para realizar pruebas bioluminiscentes en células de mamíferos.
Con ello, puede tanto realizar nuevos estudios con esta luciferasa como probar otras que forman parte del acervo del laboratorio, reunido por el investigador durante más de 30 años, principalmente a partir de insectos brasileños (lea más en: agencia.fapesp.br/29094, agencia.fapesp.br/31807 y agencia.fapesp.br/50543).
“Con este desarrollo, abrimos un abanico de perspectivas que van desde bioensayos de toxicidad de fármacos y cosméticos, evaluación del efecto de biomateriales en células humanas e incluso nuevas formas de estudiar células cancerígenas”, concluye Bevilaqua.
El artículo Selection and Engineering of Novel Brighter Bioluminescent Reporter Gene and Color- Tuning Luciferase for pH-Sensing in Mammalian Cells puede ser leído en: www.mdpi.com/2079-6374/15/1/18.
Journal
Biosensors
Article Title
Selection and Engineering of Novel Brighter Bioluminescent Reporter Gene and Color- Tuning Luciferase for pH-Sensing in Mammalian Cells
Article Publication Date
4-Jan-2025